Purificação por afinidade de gelo com água em queda de proteínas de ligação ao gelo

Expressão de AFP tipo III recombinante, MBP-TmAFP e eGFP-RiAFP

Um plasmídeo contendo uma AFP tipo III, isoforma QAE de faneca oceânica, foi obtido de Peter L. Davies (Queen's University, Canadá)31. Um plasmídeo contendo o eGFP-recombinanteRiO gene AFP foi generosamente doado por Aaron Hakim (Universidade de Yale, New Haven)32. Um plasmídeo contendo MBP-recombinanteTmAFP foi obtida do laboratório de Deborah Fass (Instituto Weizmann, Rehovot, Israel)33. Um plasmídeo contendo MBP-TmAFP foi transformado usando o método de choque térmico34 no Origami-B E. coli cepa (Novagen). Todos os outros plasmídeos foram transformados por choque térmico em BL21-DE3-PlysS E. coli variedade. Um fermentador de tanque agitado de 1 ou 5 L (Applikon Biotechnology, Holanda) foi utilizado para um processo de fermentação em batelada alimentada para produzir todas as proteínas recombinantes. As bactérias foram cultivadas sob parâmetros físicos e químicos controlados (temperatura, fluxo de ar, fluxo de oxigênio, velocidade de agitação, formação de espuma, pH e oxigênio dissolvido). Os componentes da alimentação e do meio (por exemplo, fontes de carbono e nitrogênio, sais) foram fornecidos durante o processo de fermentação por injeção direta no recipiente. O ar foi fornecido a uma taxa de 0,15–2 vvm (ou seja, volume de ar por volume de meio por minuto) para manter a concentração de oxigênio dissolvido superior a 20% da saturação do ar. O pH foi mantido em 7 pela titulação de 2M H2ENTÃO4 ou NaOH 3 M. A temperatura de cultivo foi de 37 °C e depois reduzida para 15–20 °C antes da indução com 1 mM de IPTG. A duração típica do tempo de fermentação foi de 20 a 24 horas, os valores finais de DO atingiram 60. As células foram colhidas, sedimentadas por centrifugação a 4 ° C a 4500 rpm durante 45 min e armazenadas a -80 ° C até a purificação. Cinco gramas de sedimento celular úmido foram ressuspensos em 50 mL de tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 7,5) suplementado com inibidores de protease, pré-resfriados a 4°C. As células ressuspensas foram lisadas por sonicação e centrifugadas a 4 ° C a 15.000 rpm durante 45 min. O sobrenadante do lisado foi diluído para 2,5 L e uma concentração final de 25 mM de tampão fosfato de sódio (pH 7,5, solução inicial).

Purificação por FWIP

Dois litros e meio da solução inicial bruta foram resfriados a 4°C e carregados em um tanque de pressão sob uma pressão de 2,5 bar. Reduzimos ligeiramente o fluxo de água para melhorar a eficiência da purificação. A máquina foi então ligada e iniciado um ciclo de formação de gelo, conforme explicado na seção de resultados. Durante o ciclo, ~30% da solução congelou gradualmente. No final do ciclo, antes da etapa de degelo, os cubos de gelo foram submetidos a um fluxo de ar seco para remover o líquido residual da superfície do gelo. Descobrimos que o ar era mais eficaz do que o enxágue para essa finalidade. Os cubos de gelo foram coletados e armazenados. Durante o segundo ciclo, o líquido descongelado (dreno) foi coletado e diluído com água bidestilada até atingir a concentração inicial do tampão de 25 mM e volume de 2,5 L. Esta solução foi carregada no tanque de pressão e o sistema foi ligado novamente . Após completar o número desejado de ciclos, todas as frações de gelo foram coletadas e misturadas. A série de ciclos do FWIP foi denominada primeira rodada do FWIP. Para melhorar a pureza da proteína, o gelo coletado da primeira rodada foi derretido em banho-maria a 20 ° C, e tampão fosfato de sódio 1M foi adicionado até uma concentração final de 25 mM. O gelo derretido foi usado como solução inicial para uma segunda rodada de purificação. Um diagrama esquemático do processo é mostrado na Fig.

Avaliação da pureza do IBP nas frações de gelo

O AFP tipo III foi purificado por FWIP em experimentos anteriores e uma pureza de> 95% foi verificada usando coloração de prata e medições de histerese térmica com base em valores de atividade conhecidos31. Um total de 132 mg de AFP tipo III foi diluído em uma solução bruta de lisado que não continha nenhum IBP a uma concentração de 0,16 mg/mL até um volume final de 2,5 L. Conduzimos 10 ciclos de FWIP para extrair todo o IBP do solução, que deu 7 L de gelo. O 10º ciclo continha apenas 0,6 mg de proteína, indicando que >99,5% da AFP tipo III havia sido extraída. Verificamos que o dreno não continha nenhum AFP usando SDS-PAGE da solução concentrada de dreno. O nível de pureza foi calculado medindo a quantidade de proteína total presente nas frações de gelo. Um total de 147 mg de proteína estava presente no gelo, dos quais 132 mg eram AFP tipo III. Os 15 mg de não-IBPs eram impurezas. Dado que esta quantidade foi dividida entre 7 L, e que a quantidade de impurezas permaneceu constante em todos os ciclos, conforme mostrado, estavam presentes 0,002 mg/mL de impurezas na solução final.

As análises de SDS-PAGE e concentração de proteínas foram realizadas utilizando amostras obtidas das frações gelo e dreno. A amostra da fração de gelo foi obtida coletando 5 cubos de gelo de 5 fileiras diferentes da placa metálica para evitar possíveis distorções devido a gradientes de temperatura na placa metálica. Amostras de volumes iguais (20-40 mL) das frações foram coletadas de cada ciclo e concentradas no mesmo volume usando o Vivaspin 20 (Sartorius, Reino Unido). Grandes frações de gelo até 5 L foram concentradas usando uma célula agitada de ultrafiltração de 2,5 L (Merck, Alemanha). Frações de gelo >5 L foram concentradas utilizando um sistema TFF (GE Healthcare, UK), com um ponto de corte de 3 ou 10 kDa. Os sistemas TFF podem ser obtidos com uma capacidade de taxa de concentração por hora que corresponda às quantidades de gelo produzidas pela máquina de gelo.

Extração de bromofenol

Dois litros e meio de uma solução de corante azul de bromofenol a 0,05% (p/v) (750 µM) foram carregados na máquina de gelo e deixados funcionar durante um ciclo. O gelo obtido foi analisado por espectroscopia de absorbância a 600 nm (espectrofotômetro GENESYS 10 VIS, Thermo Fisher Scientific, EUA).

Extração de lisado celular que não contém IBPs

O BL21-DE3-PlysS E. coli as células (não transformadas com um plasmídeo contendo um gene IBP) foram cultivadas num lote alimentado como descrito acima. A fração solúvel obtida de um pellet de 16,5 g foi diluída para 2,5 L com concentração final de tampão fosfato de sódio 25 mM (pH 7,5). Esta solução inicial continha 0,55 mg/mL de proteínas (observe que as proteínas não incluem IBPs). A solução inicial foi carregada na máquina de gelo e deixada funcionar. Ao final do processo, todas as frações de gelo foram coletadas e derretidas. Foram analisadas amostras da solução inicial, do gelo e das frações de drenagem. O mesmo processo foi repetido após diluição da solução de carga para 3,9 L, 5,3 L, 6,7 L, 8,1 L e 11,5 L, proporcionando soluções iniciais diluídas com a mesma quantidade de proteínas, mas em concentrações mais baixas. A concentração proteica da fração foi medida utilizando o ensaio de proteína micro BCA (descrito abaixo).

Isolamento de TmAFP

O trabalhador sombrio larvas foram tratadas como descrito anteriormente35. Resumidamente, as larvas foram aclimatadas durante 1 mês a 4 °C e armazenadas a -80 °C. Dez gramas das larvas foram esmagadas e homogeneizadas em 100 mL de tampão de bicarbonato de amônio 100 mM (pH 8) suplementado com feniltiocarbamida 0,1 M e inibidores de protease. O homogeneizado foi centrifugado a 4°C e 50.000 rpm (Sorvall WX 90 Thermo Electron Corporation, EUA) por 1 h. O sobrenadante foi diluído até um volume final de 2,5 L e concentração final de bicarbonato de amônio 25 mM (pH 8) e carregado no tanque de pressão. Após 4 ciclos de purificação, 60 mg de TmAFP (incluindo pequenas quantidades de impurezas) foi obtida nas frações de gelo. Após a segunda rodada de purificação (4 ciclos), um total de 45 mg TmAFP foram isolados. O teor de proteína nas frações II foi avaliado por espectrometria de massa (Fig. Suplementar S3) e medidas de histerese térmica devido às dificuldades associadas à identificação desta proteína pela coloração com azul de Coomassie33.

Espectrometria de massa

As amostras de proteína foram preparadas em um alvo MSP96 de aço retificado (Bruker Daltonik, Alemanha) usando HCCA (ácido α-ciano-p-hidroxicinâmico Bruker Daltonik, Alemanha) como matriz, de acordo com as recomendações do fabricante. O Padrão de Proteína I (Bruker Daltonik GmbH, Alemanha; contendo Insulina, Ubiquitina, Citocromo C e Mioglobina) e o Padrão de Proteína II (Bruker Daltonik GmbH, Alemanha; contendo Tripsinogênio, Proteína A e BSA) foram utilizados para calibrar as respectivas faixas de massa. As medidas de espectrometria de massa foram realizadas em um microflex MALDI-TOF (Bruker Daltonik GmbH, Alemanha). Os espectros ficaram na faixa de massa de 5 a 60 kDa.

SDS-PAGE e determinação da concentração de proteínas

SDS-PAGE foi realizada em gel de empilhamento de 6% e gel de resolução de 18% seguindo procedimentos comuns36. A concentração de proteína foi determinada utilizando o Micro BCA Protein Assay (Thermo Scientific, EUA) contra um padrão de albumina de soro bovino (BSA). A absorbância foi lida a 550 nm usando um leitor de ultra microplacas ELx808 (BioTek Instruments, EUA). Tampão fosfato de sódio 25 mM foi utilizado como branco.

Quantificação de fluorescência do eGFP-RiAFP

A fluorescência foi quantificada utilizando um fluorômetro leitor de placas Biotek Synergy-2 (Cary Eclipse, com acessório de luz polarizada). A concentração total de proteína foi determinada utilizando o Micro BCA Protein Assay (Thermo Scientific, EUA) de acordo com as instruções do fabricante, com a leitura da absorbância no comprimento de onda de 562 nm. O eGFP-RiA concentração de AFP foi estimada usando medições de fluorescência GFP com excitação de 485/20 nm e filtros de emissão de 528/20 nm. Todas as amostras foram concentradas no mesmo volume.

Medições de histerese térmica

As medições de histerese térmica foram realizadas usando um osmômetro de nanolitro controlado por computador, conforme descrito em outro lugar37.

Disponibilidade de dados

Quase todos os dados gerados e analisados ​​durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado (e seus arquivos de Informações Suplementares). Todos os conjuntos de dados estão disponíveis no autor correspondente mediante solicitação razoável.

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